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サッカリン含有人工甘味料は腸内細菌叢を変化させ耐糖能異常を起こしうる

Artificial sweeteners induce glucose intolerance by altering the gut microbiota.

Suez J, Korem T, Zeevi D, Zilberman-Schapira G, Thaiss CA, Maza O, Israeli D, Zmora N, Gilad S, Weinberger A, Kuperman Y, Harmelin A, Kolodkin-Gal I, Shapiro H, Halpern Z, Segal E, Elinav E.

Nature. 2014 Oct 9;514(7521):181-6.

【まとめ】
ノンカロリー人工甘味料(Non-caloric artificial sweeteners, NAS)は、世界的に広く用いられている食品添加物の一つである。NASは低カロリーであるため肥満者や糖尿病患者に有用と考えられてきたが、その安全性については以前から議論が続いている。

本研究では、C57 Bl/6マウスに市販の「サッカリン含有人工甘味料(5%がサッカリン、95%がグルコースの混合物である)」を、ヒトにおけるFDAの1日許容最大摂取量(体重あたり)をマウスに換算して摂取させた。その結果、マウス腸内細菌叢の組成や機能が変化し、それに伴って耐糖能異常が起きた。このようなNAS摂取に伴う耐糖能異常は、これらのマウスに抗生剤を投与すると起こらなくなった。また、NAS投与マウスから採取した便の細菌叢やNASを加えてin vitroで培養した便細菌叢を無菌マウスに接種しただけで、レシピエントのマウスに耐糖能異常が起きた。NAS摂取後の腸内マイクロバイオームでは、グリカン分解パスウェイの遺伝子発現が亢進しており、それにより短鎖脂肪酸(SCFAs)の増加が惹き起こされるなどして、耐糖能異常が起きた可能性が示された。ヒトにおいても、長期的なNAS摂取者はメタボリックシンドロームを示す数値が高値を示しており、健常者ボランティア7名に6日間NASを摂取させた場合にも4名に腸内細菌叢の変化を伴う耐糖能異常が起きた。このようなNAS摂取に伴う耐糖能異常は、おそらくその個人の腸内細菌叢によって、起きやすい者とそうでない者(レスポンダーとノンレスポンダー)がいると考えられた。

以上より、NASの摂取は、腸内細菌叢を変化させて耐糖能異常を起こす可能性があることが示唆された。肥満者や2型糖尿病患者がNASを大量に摂取することについては、今後再考の必要があるだろう。

【論文内容】
ノンカロリー人工甘味料 (NAS)は、高カロリー食品である砂糖を用いずに食品に甘味を加える手段として100年以上前に開発された。NAS摂取によってカロリー摂取を減らすことにより、体重減少と血糖値の正常化という健康上の有用性がもたらされると考えられている。砂糖を使わないカロリーオフの清涼飲料水やシリアル、デザートなどでよく用いられ、肥満者および耐糖能障害、2型糖尿病患者には推奨されることもある。しかし、NASは血糖を上昇させないという有用性を示す研究結果がある一方で、NASは体重を増加させ2型糖尿病のリスクを増加させるという有害性を示す結果も報告されてきた。このように相反する結果が報告されてきたことには、すでにメタボリックシンドロームを持つ患者がNASを多く摂取しているという背景もある。このような議論があるにもかかわらず、アメリカ食品医薬品局 (FDA)は現在、アメリカ合衆国において6種類の人工甘味料製品の使用を承認している。

多くのNASは摂取後分解されることなく消化管を通過し、腸内細菌叢に直接作用する。腸内細菌叢は健常人と肥満者糖尿病患者では組成や機能が異なり、逆に腸内細菌叢の違いがメタボリックシンドロームに関連することが分かっている。そこで本研究では、NASが腸内細菌叢の組成や機能を変化させて宿主の耐糖能に影響するかを検討した。

長期のNAS摂取は耐糖能異常を起こす
NASの糖代謝に対する影響を検討するため、10週齢のC57 Bl/6マウスの飲み水にサッカリン、スクラロース、アスパルテームを含有する市販の人工甘味料を添加して摂取させる実験を行った。これら3種類のNASは、約5%の人工甘味料と約95%のグルコースからなるものである。対照群には水のみ、水にグルコース、水にショ糖(sucrose)を混ぜたものを摂取させた。人工甘味料の商品名はそれぞれ、「Sucrazit」 (5% サッカリンと95% グルコース)、「Sucralite」 (5% スクラロース含有)、「Sweet’n Low Gold」 (4% アスパルテーム含有)であり、いずれも10%溶液として水に混ぜたものを摂取させた。対照群には水、10%グルコースまたは10%ショ糖の溶液を摂取させた。

摂取開始11週目には、水、グルコース、ショ糖を摂取させたマウスは同様の耐糖能曲線を示したのに対し、上記3種類のNASを摂取したマウスは著明な耐糖能異常を示した。NASの中ではサッカリンが耐糖能障害を起こす作用が最も大きかったので、以後の人工甘味料の作用の検討では市販のサッカリンを用いることとした

また、肥満の状態でのNASの影響を調べるため、高脂肪食(HFD、脂肪が総カロリーの60%を占める)を負荷したC57 Bl/6マウスに、市販のサッカリン含有人工甘味料またはコントロールとしてグルコースを摂取させた。その結果HFD負荷マウスにおいても同様に、サッカリンは耐糖能異常を起こすことが明らかになった。次に、0.1 mg/mlの純粋なサッカリンを水に加え、HFDを負荷した10週齢マウスに摂取させ耐糖能への影響を検討した。サッカリン濃度は、ヒトにおいてFDAで認められている1日許容最大摂取量 (5 mg/kg体重)をマウスに換算して用いた。この濃度は市販のサッカリン含有人工甘味量よりもサッカリン濃度としては少ないが、それでも耐糖能異常を示した。この結果は、C57 Bl/6マウスの代わりにSwiss Websterマウスを用いた実験でも同様だった。

なお、以上のマウスで摂餌量、摂水量、酸素消費量、運動量、エネルギー消費などは正常食、HFDマウスにおいてNAS投与とコントロールで同様であった。また、空腹時血清インスリンとインスリン負荷試験による血糖低下も同様の結果であった (インスリン抵抗性の程度に差がないことを示唆する)。以上から、NASはヒトと同様の人工甘味料の組成または体重あたりの量において、マウスの種類や肥満かどうかによらず耐糖能異常を起こすことが示された。

以下、本論文では「サッカリン5%、グルコース95%からなる人工甘味料」を「市販サッカリン」と呼び、100%のサッカリンを「純粋サッカリン」と呼ぶことにする。

NAS摂取による耐糖能異常は腸内細菌叢を介して起こる
食事は腸内細菌叢の組成や機能を変化させ、腸内細菌叢の変化は宿主の代謝に大きく影響することが分かっているので、NASによる耐糖能異常も腸内細菌叢の変化を介しているのではないかと考えた。そこで、正常マウスまたはHFDマウスにまずグラム陰性菌を標的とした抗生剤 (シプロフロキサンとメトロニダゾール)を投与し、NASを含む水またはコントロールの水のみを摂取させた。その結果、抗生剤A投与4週後には両者の耐糖能障害の差は消失した。グラム陽性菌を標的とした抗生剤 (バンコマイシン)を投与した場合も、同様の効果が認められた。これらの結果からNASによる耐糖能障害は、腸内常在細菌叢しかも幅広い細菌群が関与していることが分かった。

次に、市販サッカリンまたはグルコース(コントロール群)を含む水を摂取させた正常食負荷マウスの便を正常食負荷無菌マウス(germ-free mice)に移植する実験を行い、腸内細菌叢が原因になっているかどうかを検討した。その結果、便移植6日後には、市販サッカリンを摂取させたマウスから便を移植されたレシピエントマウスは、コントロール群から便移植されたレシピエントマウスと比較して耐糖能異常を示した。この結果は、HFD負荷マウスに水または純粋サッカリンのみを摂取させた場合の便移植実験でも同様の結果であった。したがって、NAS摂取による耐糖能異常は、腸内細菌叢を介して起きていることが示唆された。

NASは腸内細菌叢の機能を変化させる
次に、上記のマウスにおける腸内細菌叢の組成の違いを16S ribosomal RNA遺伝子のシークエンシングの結果をもとに検討した。まず、市販サッカリン摂取マウスは、摂取開始11週目において当初の腸内細菌叢および他のコントロール群の腸内細菌叢とは異なる組成を示していた (下の図1g)。同様に、市販サッカリンを摂取させたドナーマウスから便移植を受けたレシピエントの無菌マウスの腸内細菌叢は、主座標分析(Principal Coordinate Analysis; PCoA)において、グルコース摂取ドナーマウスから便移植を受けたコントロールマウスの腸内細菌叢とは異なるクラスターを形成していた (図1h)。
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市販サッカリンを摂取させたマウスは、40以上のoperational taxonomic units (OTUs)で細菌叢の変化を起こしていた。相対量が増加していた細菌群の多くはBacteroides属とClostridiales目に属していたが、Clostridialesと同じFirmicutes門に属する腸内常在菌量であるLactobacillus reuteriは減少していた。量が減少していた細菌群の多くも Clostridiales目に属するものであった。同様に、HFDに加え純粋サッカリンを摂取したマウスでも、腸内細菌叢の異常が起きていた。以上より、サッカリンはその形態、濃度、与えた食餌などが異なっても、おおむね同様の腸内細菌叢の異常をもたらすことが示された。

(注) Operational Taxonomic Units (OTUs、操作性分類単位):配列決定した16S遺伝子のうちある程度以上の類似度(97%以上など)を持つ配列を一つのまとまりと考え、「1菌種」として扱う単位とする。「形成されたOTU数」を「菌種数」と考え、細菌の多様性を把握するのに用いる。

次に、ショットガン・メタゲノムシークエンシングを用いて腸内細菌叢の比較を行った。16S rRNAによる検討と同様、市販サッカリンを11週間摂取させる前とさせた後の便の細菌叢を、グルコースまたは水のみを摂取させた場合のコントロールの便の細菌叢を比較した。相対的な細菌種の量を比較するために、シークエンス結果をヒトマイクロバイオームプロジェクト (HMP)のリファランスゲノムデータベース上で解析した。結果は16S rRNAを用いた解析と同様、市販サッカリンを摂取させた場合に細菌種の量の変化が最も大きかった。さらに、メタゲノム解析の結果を腸内細菌遺伝子カタログ上で解析し、グループ化した遺伝子をKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)上でどのパスウェイに当たるかを検討した。遺伝子発現の変化したパスウェイは、市販サッカリとグルコースを摂取させたマウスで変化が逆であった。市販サッカリンは95%グルコースを含むことを考えると、この違いはサッカリンによるものと考えられる。市販サッカリンを摂取させたマウスはグリカン分解パスウェイの遺伝子発現が大きく増加していた。

グリカンは発酵してさまざまな物質になるが、その中には短鎖脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)が含まれている。SCFAは宿主のグルコースおよび脂質のde novo合成の前駆体やシグナル伝達分子になるので、その増加は宿主のエネルギー吸収を増加させ肥満につながりうることがマウスおよびヒトで示されている。このパスウェイは、市販サッカリン摂取マウスの腸内細菌のうち5種類のグラム陰性および陽性細菌の増加によって起こることが分かった。そのうち2種は16S rRNA解析で示されたBacteroides属であった。さらに、市販サッカリン摂取マウスはコントロールのグルコース摂取マウスと比較して、便中のSCFAsであるプロピオン酸と酢酸が大きく増加していた。市販サッカリン摂取マウスの腸内マイクロバイオームでは、デンプン・ショ糖の代謝、フルクトース・マンニトース代謝、葉酸・グリセロリピド・脂肪酸生合成に関与する遺伝子発現が亢進し、糖輸送に関与する遺伝子発現が低下しているという、以前報告された2型糖尿病患者の変化と同様の変化が認められた。

その他にも、純粋サッカリンを摂取させたHFDマウスでは、ascorbate/aldarate代謝 (レプチン受容体欠損糖尿病マウスで増加)、LPD生合成 (代謝性エンドトキシン血症で増加)、細菌走性(肥満マウスで増加)に関与するパスウェイの遺伝子発現の増加が見られた。以上より、市販サッカリンの摂取は腸内細菌叢の機能的変化をもたらすこと、特にグリカン分解パスウェイの遺伝子発現が亢進し、エネルギー吸収の増加につながる便中SCFAsの増加が起きることが示された。

NASは腸内細菌叢を直接変化させ、耐糖能異常を促進する
次にNASの腸内細菌叢への直接の影響を検討するため、通常マウスの便をサッカリンを添加した培養液を用いてin vitroで嫌気性培養した。このサッカリン添加in vitro便培養で、培養9日目にはBacteroidetes門の増加とFirmicutesの減少が認められ、この培養産物を無菌マウスに胃管投与したところ、コントロール便投与群に比べて有意な耐糖能異常が認められた。サッカリン添加in vitro便培養を投与されたマウスの便でもBacteroides属の増加とある種のClostridialesの減少が見られた。ショットガンメガゲノムシークエンシングによっても、サッカリン添加in vitro便培養で、サッカリン摂取マウスの便と同様のグリカン分解パスウェイの遺伝子発現の増加が認められた。その他にはスフィンゴ脂質代謝に関与する遺伝子発現の増加(非肥満糖尿病マウスでの増加が報告されている)、糖輸送に関与する遺伝す発現の減少が認められた。以上より、サッカリンは腸内細菌叢の組成と機能を直接変化させ、耐糖能異常を起こしうる細菌叢の変化をもたらすことが示された。

ヒトにおいてNASは耐糖能異常に関連している
最後にヒトにおいて、長期的および短期的なNAS摂取の耐糖能にどのように影響するかを検討した。まず、長期のNAS摂取と臨床データの関連について381名の非糖尿病者 (男性44%、女性56%、年齢は43.3 ± 13.2歳)のコホートを対象に調べた。NASの摂取量 (食事質問票による)は、体重、ウエスト・ヒップ率(中心性肥満を表す)、空腹時血糖、HbA1c、ブドウ糖負荷試験 (GTT)の血糖値、ALT (肝機能障害を表す)の高値と関連があった。HbA1cは、NAS摂取が多い40名は、NASを摂取しない236名に比べて高値であった(BMIで補正しても高値だった)。さらに、これらの被験者のうち、ランダムに172名を選び出し、便の細菌叢を16S rRNA解析を用いて調べた。その結果、NASの摂取とEnterobacteriaceae科、Deltaproteobacteria綱、Actinobacteria門の量の増加とは有意な関連があった。なお、細菌叢のOTUの量とBMIの間には有意な関連は見られず、上記のNAS摂取と細菌叢の関連は肥満を介する関連ではないと考えられた。

ヒトにおいて短期的なNASの摂取が耐糖能異常をもたらすかを調べるため、普段NASを摂取しないか、ここ1週間NASを含む食物を摂取していない7名の健常ボランティア(5名が男性、2名が女性、年齢は28-36歳)にNASを摂取させて検討を行った。7日間の試験期間のうち2日目から7日目まで、FDAの1日許容最大摂取量の市販サッカリン(5 mg/体重kg)を1日3回に分け連日摂取させ、、連日GTTを行った。その結果、このような短期間でも7名中4名の被験者が1-4日目に比べ、5-7日目にGTTでの有意な血糖上昇をきたした(図4c)。また、残り3名は血糖上昇はなかった (有意な耐糖能改善もなかった) (図4d)。このように、被験者にはNASに反応して耐糖能悪化が見られた者と見られなかった者があり、反応があった者を「NASレスポンダー」、反応がなかった者を「NASノンレスポンダー」と呼ぶことにした。

NASレスポンダーの腸内マイクロバイオームは、ノンレスポンダーのNAS投与前後とは異なるクラスターを形成していた(図4e)。さらに、ノンレスポンダーのマイクロバイオームはこのNAS摂取期間を通じて変化がなかったのに対し、レスポンダーではNAS摂取によってマイクロバイオームの変化が見られた(図4f)。
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レスポンダーとノンレスポンダーのNAS摂取前(1日目)と摂取後(7日目)の便サンプルを正常食負荷無菌マウスに移植した。その結果、NAS摂取後のレスポンダーの便を移植されたレシピエントマウスは有意な耐糖能異常を示したのに対し、レスポンダーのNAS摂取前およびノンレスポンダーのNAS摂取前後の便では耐糖能異常は起きなかった。レスポンダーのマイクロバイオームを移植された無菌マウスの便では、サッカリン摂取マウスの腸内細菌叢変化と同様の変化がいくつか認められ、Bacteroides fragilis (Bacteroidales目)とWeissella cibaria (Lactobacillales目)が20倍増加、Candidatus Arthromitus (Clostridiales目)が10分の1に減少していた。

【結論】
本研究では、NASの摂取が腸内細菌叢を変化させ、耐糖能異常を起こす可能性がマウスとヒトで示された。NAS摂取による主な細菌群の変化は、以前に2型糖尿病のヒトでも報告されたBacteroidesの増加とClostridialesの減少であった。また、NAS摂取は腸内マイクロバイオームのうち、グリカン分解パスウェイの遺伝子発現を変化させ、食物からのエネルギー吸収を増加させる可能性があることが分かった。その他にもNASはマウスやヒトで糖尿病や肥満への関連が報告されている代謝パスウェイ (スフィンゴ脂質代謝やLPS生合成など)を変化させることが明らかになった。本研究は、マウスだけでなく、ヒトにおいても長期的および短期的なNAS摂取が耐糖能異常を起こしうることを示した。ヒトにおいては、NASの摂取に反応して耐糖能異常を起こすレスポンダーと起こさないノンレスポンダーがいることが分かり、このような反応の違いは個人の腸内細菌叢の組成と機能の違いによる可能性が示唆された。一般に食事に対する代謝疾患の起こりやすさには個人差があるが、これは個人による腸内マイクロバイオームの違いによるものかも知れず、もしそうだとすれば将来はマイクロバイオームに基づいた「個別化栄養療法 (personalized nutrition)」が重要になるのかもしれない。

人工甘味料は、人間の甘味に対する欲求を妨げることなくカロリー摂取を減らし、糖尿病患者の血糖を正常化させるのに役立つと考えられてきた。近年、多くの食事の変化に並行して、人工甘味料の消費も増加している。もしかしたら人工甘味料の使用は、意図に反して肥満や糖尿病増加に寄与してきた可能性もある。さらには、人工甘味料の影響には個人差があることが示唆され、それが腸内マイクロバイオームに基づく可能性についても今後検討が必要になるだろう。
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by md345797 | 2014-09-23 23:58 | その他