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カロリー制限により腸幹細胞機能が増強するが、それはnicheであるPaneth細胞のmTORC1シグナル抑制を介する

mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.

Yilmaz OH, Katajisto P, Lamming DW, Gültekin Y, Bauer-Rowe KE, Sengupta S, Birsoy K, Dursun A, Yilmaz VO, Selig M, Nielsen GP, Mino-Kenudson M, Zukerberg LR, Bhan AK, Deshpande V, Sabatini DM.

Nature. 486, 490-495, May 20, 2012.

【まとめ】
ヒトの成人組織幹細胞およびそのniche細胞が栄養状態にどのように反応するかはよく分かっていない。哺乳類の腸幹細胞(intestinal stem-cell; ISC)のnicheであるPaneth細胞は、カロリー制限に反応して幹細胞機能を増強する。カロリー制限は、Paneth細胞のmTORC1を低下させることによりISCの機能増強をもたらすことが明らかになった。カロリー制限中でも、Paneth細胞のmTORC1を強制的に活性化させると、ISC増強効果が消失した。逆にrapamycin投与でmTORC1シグナルを低下させると、カロリー制限同様の効果が認められた。さらに、Paneth細胞でBst1(=paracrine因子であるcyclic ADP riboseを産生する外酵素)の発現を増加させると、ISC機能に対するカロリー制限やrapamycinと同様の効果が起きた。以上の結果より、mTORC1は、細胞非自律的(non-cell-autonomously)に、腸幹細胞自己複製を調節し、個体のエネルギー状態と腸管細胞機能を結びつける役割を担っていることが明らかになった。

【論文内容】
哺乳類の組織幹細胞は、微小環境すなわち「niche」からのシグナルを受けて、自己複製するか分化するかを決定している。マウスでは、カロリー制限により神経前駆細胞からのニューロンの新生が促進されたり、年齢による造血幹細胞の数や機能の低下が抑制されたりすることが知られている。しかし、カロリー制限がどのように幹細胞に影響し、それに幹細胞nicheがどう関わっているかは不明である。

小腸は、幹細胞と急速に分裂する増殖細胞を含む陰窩(crypt)と、吸収性腸管細胞からなる繊毛(villi)によって構成される。絶食と再摂食に反応して、腸管は繊毛の長さや陰窩の深さなどの構造変化を起こす。最近の研究により、腸幹細胞(ISCs)とそののnicheであるPaneth細胞との相互作用が明らかになってきた。大部分のISCはLgr5マーカー陽性であり、Lgr5+ ISCs(crypt base columnar cellsとも呼ばれる)は、陰窩底でPaneth細胞に挟まれた細胞で、自己複製および分化することができる。In vivoでPaneth細胞が失われるとLgr5+ ISCsの数は減少する。その一方、Lgr5+ ISCs にPaneth細胞をin vitroで加えると、「ミニ腸管」とも言える臓器様の自己複製体(organoid)を形成する。このように、Paneth細胞は腸幹細胞nicheの不可欠な因子であることが分かっている。

カロリー制限により幹細胞とniche細胞の数は増加する
4-28週の間カロリー制限をしたマウスでは自由摂食したマウスに比べ、絨毛の量および長さが低下し、ISCsおよびPaneth細胞が増加した。すなわち、カロリー制限は、腸管細胞への分化を抑制してISCsの自己複製を促進する。さらに、nicheであるPaneth細胞がカロリー制限へのISCsの適応を調節している可能性がある、と考えられた。実際、カロリー制限により、crypt base columnar cellsへのBrdU取り込みは増加していた。

カロリー制限により腸管の再生は促進される
カロリー制限をしたマウスから単離した陰窩は、自由摂食マウスに比べin vitroでorganoidを形成する率が高かった。また、カロリー制限は陰窩の再生をin vivoで促進するかを検討するため、両マウスに致死量の放射線を照射し72時間後の腸管を採取したところ、カロリー制限マウスの方が生存陰窩とKi67+腸管前駆細胞の数が多かった。したがって、カロリー制限はin vivoでもin vitroでもISCsの再生能を促進することが示された。

カロリー制限によりnicheを介してISC機能が増強される
次に、Lgr5-EGFP-IRES-creERT2ノックインマウスよりLgr5-EGFP hi ISCsを単離した。その結果、カロリー制限したノックインマウスは、自由摂食マウスに比べてLgr5-EGFP hi ISCsおよびPaneth細胞が多かった。ISCsは、カロリー制限に対しPaneth細胞に対し自律的に(autonomously)、または非自律的に(non-autonomously)に反応するのかを検討するため、別々に培養したところorganoidは形成されず、一緒に培養したときにのみorganoidを形成した(ISCsの反応にはPaneth細胞が必要、すなわちnon-autonomous)。カロリー制限をしたマウスのPaneth細胞と一緒に培養した方が、よりISCsがorganoidを形成したため、適切なnicheシグナルがあった時に幹細胞機能が最も増強されることも分かった。

カロリー摂取はnicheのmTORC1を活性化する
mTORC1は個体の栄養状態の主要なセンサーであるため、カロリー制限のPaneth細胞における効果がmTORC1を介しているかを検討した。腸管のmTORC1活性(S6のリン酸化)は絶食で低下し、再摂食またはインスリンによりPaneth細胞のmTORC1を活性化された(なお、ISCsのmTORC1は活性化されなかった)。空腹時に単離したPaneth細胞でもS6リン酸化は低下しており、インスリン刺激後に単離したPaneth細胞ではリン酸化が増加していた。さらにカロリー制限マウスから単離した陰窩においても、S6およびS6K1(=mTORC1の直接の基質)のリン酸化は低下していた。

NicheのmTORC1はカロリー制限の効果を調節する
Paneth細胞のmTORC1活性の低下がカロリー制限によるISC機能の増強をもたらしているのかを調べるため、Rheb2(mTORC1 activator)を全身で発現する(doxycyclineでRheb2を導入できる)トランスジェニックマウスを作製した。空腹時であっても、Rheb2発現を導入するとPaneth細胞mTORC1が活性化された。さらに、このPaneth細胞をISCsと一緒に培養してもorganoidの形成は少なかった。すなわち、空腹時でもPaneth細胞のmTORC1が活性化されていればカロリー制限に伴うISC機能の促進は起こらないことが示された。

次に、rapamycinによるmTORC1阻害がカロリー制限の効果を模倣するかを検討した。Rapamycinを4週間マウスに投与したところ、ISCsおよびPaneth細胞の量は1.5倍以上に増加した。1週間rapamycinを投与しただけのマウスから単離した陰窩でも、カロリー制限後と同様のorganoid形成が見られた。なお、mTORC2特異的なコンポーネントであるRictorを腸で欠損させたマウスでも同様のorganoid形成が見られたため、rapamycinはmTORC1および、それとは独立にmTORC2も阻害することにより、organoid形成(陰窩のクローン原性)を促進すると考えられる。

Rapamycin投与マウスから単離されたPaneth細胞は、コントロールマウスのISCsと混ぜてもorganoidを形成したため、rapamycinもカロリー制限と同様、非自律的(non-autonomous)に作用していると考えられる。また、rapamycin投与とカロリー制限は、陰窩からorganoidを形成するために相加的な効果は見れられなかったので、rapamycinとカロリー制限は共通にPaneth細胞のmTORC1シグナル抑制を介してISC機能を促進していることが示唆された。

カロリー制限はPaneth細胞のBst1を増加させる
カロリー制限マウスおよび自由摂食マウスからフローサイトメトリーで単離したPaneth細胞の遺伝子発現プロファイルを比較し、カロリー制限で発現が増加した遺伝子としてBst1 (bone stromal antiegen 1)に着目した。Bst1は骨髄間質細胞に発現して造血前駆細胞の増殖を促進する。Bst1はNAD+をcyclic ADP ribose (cADPR)に変換する外酵素(ectoenzyme)であり、cADPRはヌクレオチドトランスポーターを介して細胞内に取り込まれ、細胞増殖を促進することが知られている。カロリー制限によって、Paneth細胞のBst1のmRNAおよび蛋白が増加した。また、cADPRを陰窩に添加して培養すると、自由摂食マウスからの陰窩でもorganoid形成を促進した。最後に、Bst1がカロリー制限によるorganoid形成の促進に必要なのかを検討するため、Bst1 mRNAをノックダウンしたところ、カロリー制限マウスの陰窩からのorganoid形成は抑制された。また、このBst1の低下をrescueするためには外因性にcADPRを添加するのみで十分であった。以上より、カロリー制限は、mTORC1依存性にPaneth細胞でのBst1発現を導入し、これがcADRPの増加をもたらし、ISCs自己複製を促進する(organoid形成が増加する)、と考えられた。

【結論】
個体のカロリー制限は、腸幹細胞(ISC)nicheであるPaneth細胞のmTORC1シグナルを抑制し、ISCの自己複製を増加させるというメカニズムが明らかになった。カロリー制限時には、このメカニズムを介してISC自己複製が促進され、ISCsから腸管細胞への分化が少なくなることが想定される。このメカニズムは、Paneth細胞における外酵素Bst1の発現増加により細胞外のcADPRが増加するために、ISC機能が促進される、という細胞非自律的(non-cell-autonomous)な機構を介している。以上より、mTORC1の阻害剤またはBst1の模倣薬(それぞれrapamycinとcADPRとしてFDAに認可されている)は腸再生や腸機能の改善に有用である可能性が考えられた。

【参考】
腸幹細胞再生の動画:Hubrecht Instituteのページ(Movie 1:The gut, a clonal conveyer belt)より。
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by md345797 | 2012-06-29 07:59 | 再生治療

十二指腸-空腸バイパス術による糖尿病の急速な血糖低下は、空腸における栄養素の感知を介して起こる

Jejunal nutrient sensing is required for duodenal-jejunal bypass surgery to rapidly lower glucose concentrations in uncontrolled diabetes.

Breen DM, Rasmussen BA, Kokorovic A, Wang R, Cheung GW, Lam TK.

Nat Med. 2012 May 20 Published online.

【まとめ】
胃腸パイパス術は2型糖尿病や肥満患者の代謝を改善するが、そのメカニズムはよく分かっていない。十二指腸-空腸バイパス術(duodenal-jejunal bypass surgery; DJB)は、十二指腸と近位空腸に栄養素(グルコースや脂質)を通過させなくすることによって、非肥満2型糖尿病ラットの血糖を低下させることのできる、実験的な外科技術である。

この研究ではまず、一定のインスリン濃度を保ちながら(膵クランプ下で)、正常ラットの空腸内に(空腸カテーテル経由で)栄養素を直接注入すると、腸-脳-肝のネットワークを通じて、内因性糖産生が抑制されることを示した。ここで、空腸での糖取り込みおよび長鎖脂肪酸アシルCoA形成を阻害すると、それぞれグルコースおよび脂質注入による内因性糖産生抑制効果が阻害された。また、streptozotocin(STZ)投与糖尿病ラットにDJBを施行したところ、急速な(2日後の)血糖低下が認められた。このDJBによる血糖降下は、空腸糖取り込みや長鎖脂肪酸アシルCoA形成阻害によって抑制された。さらに、インスリン欠乏自己免疫性1型糖尿病ラット(BB-dpラット)にDJBを行った場合でも、血漿インスリン濃度、摂食、体重の変化を伴うことなく、速やかに血糖が低下した。以上の結果より、「空腸における栄養素の感知」によるグルコース調節機構が、コントロール不良の糖尿病ラットにおけるDJB後の血糖コントロール改善に必要であることが明らかになった。

【論文内容】
十二指腸-空腸バイパス術(DJB)は、Roux-en-Y胃バイパス術の代謝効果のメカニズムを検討するために開発された実験的な技術である。DJBは非肥満2型糖尿病のげっ歯類やヒトで血糖を低下させる。その正確なメカニズムは不明であるが、十二指腸で栄養素を感知することによって、げっ歯類やヒトで腸-脳を通じて摂食が低下したり、げっ歯類で腸-脳-肝を通じて内因性糖産生が抑制されるメカニズムが知られている。ただし、十二指腸だけでなく小腸の他の部位においても、末梢の糖代謝を調節している可能性が残されている。実際、げっ歯類やヒトの空腸に脂肪を注入すると摂食が低下することが報告されている。この空腸における脂肪の感知のメカニズムは不明だが、腸-脳を通じた機構が想定される。この研究では、「空腸における栄養素の感知」(jejunal nutrient sensing)がグルコース代謝を調節しているのか、もしそうならその機構はDJB後の糖尿病の改善に役立っているのかについて検討した。

空腸カテーテルを用いて空腸内に直接グルコースを注入したラットで、膵クランプ下での(=インスリンを一定の基底濃度に保って)グルコース注入量・内因性糖産生量を測定した。その結果、空腸へのグルコース直接注入によって、クランプにおけるグルコース注入率が増加、内因性糖産生が抑制された。同量のグルコースを門脈内に注入したラットでは、これらの効果は見られなかったため、空腸に注入したグルコースは(門脈ではなく)空腸内で感知されていることが示唆された。

次に、空腸管腔でのグルコース取り込みを阻害するphlorizin(Na+依存性グルコーストランスポーター阻害剤)をグルコースと一緒に注入したところ、空腸グルコース注入に伴うクランプでのグルコース注入率の増加・内因性糖産生の抑制は消失した。なお、同量のphlorizinを経静脈的に全身投与したり、十二指腸や回腸に注入したりした場合は、上記の効果はなかった。これらの結果から、膵クランプ下のインスリン濃度において、「空腸におけるグルコースの感知」が内因性糖産生抑制につながることが示唆された。

次に長鎖脂肪酸(LCFA)の源であるIntralipidを空腸に注入し、同様にクランプ時の内因性糖産生への効果を検討した。Intralipidの空腸への注入により、クランプ時のグルコース注入速度は増加し、内因性糖産生は抑制された。Intralipidと一緒にacyl-CoA synthase阻害剤であるtriacsin Cを注入すると、内因性糖産生抑制は消失した。したがって、空腸におけるLCFA-CoAの形成が、「空腸における脂質の感知」による内因性糖産生抑制に必要であることが示唆された。
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上記の、「空腸におけるグルコース・脂質の感知」による内因性糖産生抑制は、(1)空腸迷走神経支配を阻害する麻酔薬tetracaineを同時注入したり、(2)脳の孤束核(nucleus of the solitary tract; NTS)にMK-801(NMDA受容体阻害剤)を注入したり、(3)肝の迷走神経分枝の切断(hetapic branch vagotomy; HVAG)を行ったりした実験において、阻害されたため、この効果は腸-脳-肝を通じた経路(上図参照)によるものと考えられた。

次に、正常ラットおよび非肥満STZ-誘導性インスリン欠乏糖尿病ラットにDJBまたはsham手術を行った。DJB手術は、左下図のようにABを切断してCにつなぎ、Bの断端をAの断端につなぐことによって、右下図のようにAB部分(十二指腸・近位空腸)をバイパスする。
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手術2日後、正常ラットではDJB手術による血糖・インスリン値の変化はなかったが、STZラットではDJBにより血糖が正常化した。STZラットでは、DJBにより血漿インスリン・グルカゴン値は変化しなかったが、活性GLP-1値は増加していた(GLP-1増加の意義は不明)。STZラットのsham、DJB群ではいずれも(手術後のため)摂食が低下したが、両群の間で摂食・体重に差はなかった。すなわち、DJBは、STZによるコントロール不良の糖尿病を急速に(2日間で)改善したが、この改善はインスリン・摂食・体重の変化によるものではなかった。

次に、STZラットのDJB手術の後、空腸カテーテル(下図、Bから3 cm遠位)を挿入した。
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そこから、phlorizinまたはtriacsin C、またはその両方を注入した場合、STZ-DJBラットの摂食後の血糖は、vehicle注入の場合に比べて増加した(STZ-sham群と同程度の血糖になった)。次に、STZラットの空腸カテーテルからグルコースを注入したところ、血糖と内因性糖産生は正常化した(このとき、血漿インスリン・グルカゴン濃度の変化は起きなかった)。すなわち、DJBでの急速な血糖改善効果には、「空腸における栄養素の感知」が必要であることが分かる。なお、phlorizinとtriacsin Cの両方を投与した場合でも、それぞれ一方のみの投与の場合と比べ、STZ-DJBラットの糖代謝改善がより阻害されるということはなかった。したがって、グルコースの感知と脂質の感知メカニズムは、脳と肝にかけての経路で合流している可能性がある。

DJBの血糖低下効果は一時的なものなのか、それとも外科手術後の影響が消失しても残るのかを検討するため、STZ-shamとSTZ-DJBラットの術後14日目までの血糖を観察した。手術14日後にはSTZ-shamラットの血糖が手術前の血糖値(400mg/dl程度)まで戻ってしまったのに対し、STZ-DJBラットの血糖はDJB手術14日後でも低下したままであった。

さらに、非肥満のdiabetes-prone BioBreeding(BB-dp)ラット(自然発症自己免疫性1型糖尿病マウス。高度の低インスリン血症をきたす)にDJBを施行し、血糖低下が見られるかを検討した。BB-dpラットで高血糖、低インスリン血症、高グルカゴン血症の発症2日後にDJBまたはsham手術を行った。手術後、sham群は高血糖のままで多くは術後6日以内に死亡したのに対し、DJBを受けた群は術後2日以内に血糖が低下した。DJB群の摂食、体重、血漿インスリン、グルカゴン、活性GLP-1濃度はsham群と有意差がなかった。このDJBの血糖低下効果は術後6日目まで継続したが、6日目の時点ではDJBを受けたラットの血漿インスリン値は増加していた。なお、DJBを受けたラットの5匹中4匹は3週後まで生存した。

STZラットでDJBが術後14日目までの血糖を低下させたのには、「空腸による栄養素の感知」が関与しているかを検討するため、STZ-shamラットの術後14日目の血糖と同程度(325mg/dl程度)に血糖が上昇したSTZラットの空腸にグルコースを注入した。空腸グルコース注入によりSTZラットの血糖と内因性糖産生は(正常化まではいかないものの)低下した。したがって、DJBによる慢性(14日後)のグルコース低下効果には、空腸による栄養素の感知が部分的に関係していると考えられる。

【結論】
本研究では、非肥満コントロール不良の糖尿病ラットにおいて、DJBによる早期の血糖コントロール改善には、「空腸における栄養素の感知」が必要であることを示した。また、DJBは、インスリン欠乏STZラットおよび自己免疫1型糖尿病ラットの血糖を、血漿インスリン値、摂食、体重の変化を伴うことなく、急速に(2日目に)低下させた。これらのラットにおけるDJBの血糖低下効果は2日目以降も持続した。

Bariatric surgeryは2型糖尿病の血糖を低下させることが知られているが、DJBが非肥満2型糖尿病のげっ歯類やヒトで血糖を効果させるという報告は少ない。本研究により、食事直後の空腸への栄養素の流入増加が、DJBによる血糖低下効果をもたらしていることが示唆された。
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by md345797 | 2012-06-05 01:01 | シグナル伝達機構