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Resveratrol補充により、正常耐糖能女性の代謝機能は改善しなかった

Resveratrol supplementation does not improve metabolic function in nonobese women with normal glucose tolerance.

Yoshino J, Conte C, Fontana L, Mittendorfer B, Imai S, Schechtman KB, Gu C, Kunz I, Fanelli FR, Patterson BW,Klein S.

Cell Metab. Published online October 25, 2012.


【まとめ】
Resveratrolは、代謝異常のマウスおよびヒトで代謝を改善することが報告されているが、正常耐糖能の非肥満者の研究はなされていない。そこで、非肥満・閉経後の正常耐糖能女性に対する、12週間のresveratrol 投与(75 mg/day)のランダム化二重盲検プラセボ比較試験を行った。その結果、resveratrol投与により、体組成、安静時代謝率、血漿脂質、炎症性マーカーは変化しなかった。安定アイソトープラベルトレーサー注入を行う2段階高インスリン正常血糖クランプを行ったところ、resveratrolにより肝・筋肉・脂肪組織でのインスリン感受性は増加しなかった。同様に、resveratrolにより骨格筋や脂肪組織でのSIRT1NAMPTPPARGC1Aの発現、AMPKのリン酸化に影響は見られなかった。以上より、非肥満、閉経後の正常耐糖能女性では、resveratrol投与の代謝に対する有効性は認められなかった。

【論文内容】
天然ポリフェノールであるresveratrolは、カロリー制限と同様の代謝改善効果をもたらすとされている。そのため、resveratrolサプリメントの売り上げは、米国だけでも年間3000万ドルに達しているという。現在までのデータは、高脂肪食による肥満モデルマウスにおいて、resveratrolがインスリン抵抗性や脂質を改善、炎症や酸化ストレスを抑制し、寿命を延長するというものであった。それに対し、正常マウスでは、インスリン抵抗性や脂質、寿命はresveratrolによってさらに改善されることはないことが報告されている。最近、肥満の2型糖尿病または耐糖能異常患者にresveratrolを投与するとインスリン感受性とミトコンドリア機能が改善し、炎症が抑制されることが示されたが、一般の非肥満の正常耐糖能者で同様の効果があるかは分かっていない。そこで、非肥満(正常および過体重)女性を対象に、12週間resveratrol(75mg/日)を補充するランダム化二重盲検プラセボ比較試験を行った。

Resveratrol投与による副作用はなかった
Resveratrol補充を受けた群(n =15; 58.2 ± 4.0歳)とプラセボ服用群(n = 14; 59.8 ± 4.3歳)のベースラインの特徴は同じであった。Resveratrol服用による副作用は認めず、resveratrol群で血中のresveratrolおよびdihydroresveratrolの値が上昇していた(プラセボ群ではいずれも認めず)。

Resveratrol補充は、体組成、代謝指標、インスリン感受性に影響なかった
Resveratrol補充の12週後の体重、体組成(脂肪量、除脂肪体重、腹腔内脂肪量、肝内トリグリセリド量)に変化なく、血漿グルコース、インスリン、脂質、adiponectin、leptin、炎症性マーカー(CRP、IL-6)、HOMA-IR、安静時代謝率も変化がなかった。より厳密にインスリン感受性を評価するため、高インスリン正常血糖クランプを行った、resveratrol投与により、肝(インスリンによる糖産生抑制)、脂肪組織(インスリンによるパルミチン酸放出抑制)、骨格筋(インスリンによる糖の消失率)に差はなく、インスリンリン感受性の改善は認めなかった。


Resveratrol補充は、代謝に有効な分子の変化をもたらさなかった
動物実験によると、resveratrolの効果は、AMPK、NAD+生合成、SIRT1(NAD+-dependent protein deacetylase)、PGC1α(PPARGC1A)、Ucp3発現増加によるミトコンドリア生合成の増加、という経路を介していることが知られている。さらにresveratrolによってSIRT1、NAMPT(nicotinamide phosphoribosyltransferase、NAD+合成酵素)、PPARGC1A、UCP3の発現が増加する。ところが、この研究で骨格筋と脂肪組織でのこれらの発現を調べたところ、いずれもresveratrol投与により変化はなかった。さらにマイクロアレイにより、resveratrolで影響を受ける経路を検討するため、骨格筋・脂肪組織サンプルでマイクロアレイを用いたgene set enrichment analysis (GSEA)を行った。しかし、resveratrolはミトコンドリア機能、炎症、AMPK経路の遺伝子発現には変化を与えず、骨格筋において2つの経路(KINESIN_COMPLEX, false discovery rate [FDR] = 0.015; UBIQUITIN_LIGASE_COMPLEX, FDR = 0.216)に影響したのみであった。さらに、resveratrolは、骨格筋のAMPKのリン酸化やその経路に影響を与えなかった。

【結論】
Resveratrolは、肥満や代謝異常のヒトにおいてのみ代謝状態を改善するが、非肥満・正常耐糖能の女性には効果はなかった。
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by md345797 | 2012-10-26 17:41 | エネルギー代謝

人工多能性幹細胞 (iPS細胞)の過去・現在・未来

Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.

Yamanaka S.

Cell Stem Cell. 2012 Jun 14;10(6):678-84.

【総説内容】
2006年、マウス線維芽細胞に同時に4つの遺伝子を導入することで、ES細胞(ESC)と同じ特性をもつ幹細胞を作製しiPS細胞(iPCs)と名付けた。2007年には、同様のアプローチ法でヒト線維芽細胞からヒトiPSCsを作製、同日、James Thomsonのグループから異なる因子の組み合わせを用いたヒトiPSCの作製が報告された。

iPSCs作製につながる3つの流れの合流

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第1の流れは、核移植によるリプログラミング(細胞の「初期化」)であり、1962年にJohn Gurdonがカエルの未受精卵に成体の腸細胞の核を移植することによって幼生(オタマジャクシ)を作製したことに始まる。30年以上後になって、Ian Wilmutは乳腺上皮細胞を用いた体細胞クローニングによって、初のクローン哺乳類であるDollyを誕生させた。これらにより、分化した細胞が全臓器への発生に必要な遺伝情報を持っていることが示され、卵母細胞は体細胞核をリプログラムしうる因子を含んでいることが明らかになった。そして2001年、多田高(京都大学)のグループが、ESCsが体細胞をリプログラムする因子を含んでいることを示した。

第2の流れは、「マスター」転写因子の発見である。1987年、Drosophilaの転写因子Antennapediaを異所性に発現させると、触角の変わりに脚が形成されることが示された。同年、哺乳類の転写因子MyoDは線維芽細胞を筋肉細胞に変換することが見出された。これらの結果により、細胞系列の運命決定を担う「マスター調節因子」としての転写因子の概念がもたらされた。

第3の流れは、ESCsに関する研究である。1981年に最初のマウスESCsが作製された後、Austin Smithらは多能性(pluripotency)の長期維持を可能にする培養条件を確立した。マウスESCsの維持に必要な因子の一つがleukemia inhibitory factor (LIF)であり、ヒトESCsが作製されると、basic fibroblast growth factor (bFGF)を用いた培養条件が確立した。前の2つの流れによって、このグループは、「卵母細胞またはESCsのいくつかの因子の組み合わせが体細胞をリプログラムして胚の状態(embryonic state)に戻す」という仮説を立て、これらの因子を同定する実験を進めることにした。さらに第3の流れの培養条件を用いて、多能性細胞を培養することを通じて、iPSCs作製に必要な4因子を同定することができた。

iPSC技術の成熟と理解
最初のマウスiPSCsの報告のすぐ後から、他のグループでマウス・ヒトの細胞に因子を導入してリプログラミングする検討が繰り返された。iPSC技術の利点の一つは、その単純さと再現性であり、多くの研究室がそのメカニズムと修正手順の検討を始めた。当初、iPSCs作製の効率は低く、遺伝子導入した線維芽細胞がiPSCsになるのは1%に満たなかった。したがって、iPSCsは、培養中の線維芽細胞に含まれるごくわずかの幹細胞または未分化細胞由来である可能性も否定できなかった。しかし、その後の研究では、最終段階まで分化したリンパ球や有糸分裂後のニューロン由来のiPSCsも作製できることが示された。現在、ほとんどの(全部ではないが)体細胞は、(効率の違いはあるとはいえ)iPSCsになれる可能性を持っていることが分かっている。

ではなぜ、少数の因子が体細胞のリプログラミングを起こすことができるのか?リプログラミング因子は、因子を導入した細胞の1%以上でリプログラムの過程を開始するが、そのリプログラミング過程は多くの細胞で完成されないのではないか?または、よく分かっていない確率論的なイベント(stochastic events)が十分なリプログラミングが起こるのには必要なのかもしれない。

当初、iPSCsはretrovirusまたはlentivirusを用いて、遺伝子変異を挿入することにより作成されており、遺伝子治療における場合と同様の副作用を起こす危険はあった。Retrovirusを用いて作製されたマウス由来のiPSCsはc-Mycトランスジーンが発現しない限り明らかな異常はなかったが、ヒトiPSCsの長期的な安全性はこのマウスの実験だけでは保障されなかった。また、retrovirusはiPSCsに免疫原性をもたらすため、細胞移植治療に用いる場合には、宿主ゲノムに取り込まれるベクターを用いる導入方法は避ける必要があった。そこで、宿主ゲノムに取り込まれない(integration-free)でiPSCsを作製する方法がいくつも報告された。例えばプラスミドベクター、センダイウイルス、アデノウイルス、合成RNAs、蛋白を用いる方法などが報告された。さらに、小分子によるリプログラミングの導入も検討された。これらのうち、プラスミドとセンダイウイルスによるものは多くの研究室で用いられている。京都大学CiRA(Center for iPS Cell Research and Application)では、単純さと再現性の観点から、再生治療ではエピソームプラスミドを、in vitroの実験ではretrovirusかエピソームプラスミドを用いている。

iPSC技術から派生する新たな流れ
Rudolf Jaenischらによる鎌状赤血球貧血マウスでの研究を初めとして、iPSCsを用いた再生医学の進展が進んでいる。例えば、Parkinson病、脊椎損傷、黄斑変性の治療などである。患者由来のiPSCsも疾患モデルや薬剤ライブラリーからのスクリーニングに有用である。

George Daley およびKevin Eggan による研究に始まり、ここ3年の間に疾患特異的iPSCsを用いた研究において100以上の報告がなされている。単一遺伝子疾患のみならず、晩発性の多遺伝子疾患(Parkinson病、Alzheimer病、統合失調症)などに、患者特異的iPSCsが用いられメカニズムの解明と治療の応用につながる研究が進んでいる。iPSCs由来の体細胞(特に心筋細胞と肝細胞)を用いた毒性試験は、現在のアプローチに変わる方法として用いられうる。

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さらなる医学への応用としては、iPSCsの動物のバイオテクノロジーへの応用があげられる。サル、ブタ、イヌの iPSCsによりこれらの動物を作製することができるようになり、これらの動物の疾患モデルの作製やヒトの遺伝的疾患で欠損している酵素などの大きい動物でのモデル作製が可能である。この技術は将来的には、絶滅の危機に瀕している動物の保護にも役立つ可能性もある。iPSCsの重要な応用として報告されているのが、中内啓光(東京大学医科学研究所)による、膵を欠損したマウスに、ラットiPSCsに膵発生に必要な遺伝子を導入して作ったラット膵を作製した研究であろう。将来はヒトの移植でも、同様の戦略を用いて、臓器作製が行われるかもしれない。

他のiPSCs技術に派生してできた流れは、ある体細胞系列から他の体細胞系列への「直接リプログラミング(direct reprogramming)」である。Douglas Meltonは、3つの転写因子を組み合わせて用いることにより、マウス膵の外分泌細胞を内分泌細胞に変換することに成功した。その後、線維芽細胞を神経細胞、肝細胞、心筋細胞、造血前駆細胞にin vitroで変換させる方法が報告された。直接リプログラミングは単純で速いが、目的の細胞を十分な量得られるかが一つの課題となっている。この方法を進めた先には、in situ direct reprogramming 法の開発が進んでいる(マウスの心筋線維芽細胞をin vivoで直接心筋細胞に変換する検討)。

iPSCsはESCsとは異なるのかという大問題
iPSCsはESCsと異なるのか、もしそうであればどのような機能的な違いがあるのか?iPSCs研究当初はiPSCsとESCsとの類似性には驚かされたが、2009年以降、それらの違いが報告されるようになってきた。例えば、3系統のヒトESC株と5系統のiPSC系統では、マイクロアレイを用いた検討により、数百種の遺伝子発現が異なることが報告された。すなわち、iPSCsは、多能性細胞の中でもユニークなサブタイプと考えられる。さらに、iPSCsではドナー細胞の遺伝子発現が持続する、というESCsとの違いも示された。また、iPSCsとESCsではDNAメチル化に差があること、BMP3のようにメチル化される遺伝子が異なること、それにより、iPSCsにはドナー細胞のepigeneticな記憶が存在することが示された。しかし他の研究では、iPSCsとESCsを遺伝子発現やDNAメチル化によって区別するのは難しい、または区別できないという結論も出ている(違いがあるとしても、研究室ごとの遺伝子導入や培養条件の差によるものであるとしている)。検討に用いたiPSおよびESのクローン数が多い研究の方が、少ない研究よりも、「iPSCsとESCsは遺伝子発現・DNAメチル化の違いで区別できない」とする結論に至る明らかな傾向がある。

もう一つ重要な論点は、細胞の分化能力においてiPSCsはESCsと機能的に異なっているかということである。2010年、Huらは5系統のヒトESCクローンと12のiPSCクローンを神経細胞に分化させた実験で、ESCは90%以上の効率で神経細胞(Pax6陽性細胞)に分化したのに対し、iPSCsは10-50%程度の低効率でしか分化しなかったことを示している。一方、2011年、Boultingらは16のヒトiPSCクローンを運動ニューロンに分化させる実験で、13のクローンがESCsと同等の効率で分化したことを示している。このように、iPSCsとESCsの類似性に関してはいまだに結論が出ていない。

ESCクローンには多様性があることがよく知られており、同様にiPSCsにも遺伝子発現・DNAメチル化の点で多様性があると思われるが少なくとも一部のiPSCクローンはESCクローンと区別不能である。何がiPSCクローン間の多様性をもたらすかは興味深い問題である。Hochedlinger の研究室とJaenischの研究室でそれぞれ同様の方法でマウスiPSCsを作製したが、前者はDlk1-Dio3遺伝子クラスターのインプリンティングが見られない(4倍体補完法によるall-iPSC マウスの作製は不可能である)のに対し、後者では正常に見られる(all-iPSC マウスの作製は可能、厳密に「多能性(pluripotent)」といえる)という違いが見られた。両研究室の方法の違いは、後者で発現カセットの量の違いにより、iPSCsにおけるOct4とKlf4の発現が多かった、ということであった。このようにiPSC作製時のリプログラム因子の量や培養条件の違いによって、iPSCsのepigeneticな状態や多能性に変化が生じると考えられる。iPSCsの質の差は、技術的なばらつき(因子の組み合わせ、遺伝子導入法、培養条件など)により、さらにはリプログラミング時の確率的なイベントにもよるため、コントロール不可能である。したがって医療への応用においては、それにふさわしいiPSCクローンを同定するための、評価と選択が不可欠である。

人工多能性の「ダークサイド」とは?
iPSCsの潜在的な異常として、体細胞変異、コピー数変異、(細胞移植に用いる際の)免疫原性などが報告されているが、これらは誇張されている部分もある。しかし、iPSCsに見られる多くの遺伝的な差異はもとの体細胞にすでに存在しており、リプログラミング過程そのものから起きるわけではないようである。他の研究では、ある種のiPSCクローンはもとの細胞に比べ遺伝的変異がほとんどなくall-iPSCマウスを作ることができるとされている。Mycトランスジーンを持っていないiPSCs由来のマウスは有害な遺伝的変異がないため、機能の異常が見られない。免疫原性に関しては、トランスジーンのないiPSCs に対しては免疫反応が弱いことが報告されている。

なぜ、ESCsとiPSCsはこのように似ているのか?
ESCsとiPSCsは由来の細胞や作製方法が異なるのに、なぜ非常に似ているのだろうか?人工の細胞(iPSCs)と自然に存在する細胞(ESCs)の間で、このように類似性のある例はほかには見られない。ESCs/iPSCsから作製した神経細胞や心筋細胞のようなある種の(人工)体細胞は、in vivoに存在する自然の体細胞に似てはいるが、非常に違うところもある。その中で、ESCsとiPSCsが似ていることは、多くの点で例外的といえる。

一つの説明としては、ESCsも実は人工細胞である、ということである。ESCsは生理的条件では存在せず、内部細胞塊(ICM)から特定の培養条件下で選択し樹立した細胞だからである。ESCsは多くの点で、ICM内の大多数の細胞とは異なっている。例えば、ICM内の細胞は全体的にDNAメチル化が少ないが、ESCsは高レベルでメチル化している。Rasファミリー遺伝子の一つERasは、マウスESCsに特異的に多く発現しているが、胚では発現していない。また、ESCsは胚で見られるよりも長いテロメアが認められる。以上のことなどから、ESCsとiPSCsは、2種類の人工細胞としてその関係や類似性を考えるのがよいだろう。

結語
それならば、ESCsはiPSCsにとって究極のコントロール細胞またはゴールドスタンダードと言えるのか?答えはNoと思われる。ただし、この点に関しては将来の研究で、iPSCsがESCsと並行して新しい組織や臓器を作れる能力があるかさらなる検討が必要だろう。

iPSC技術は、幹細胞治療を含む多くの応用が可能と考えられる。いくつかの導入方法によってさまざまな質のiPSCクローンが作られてきたが、臨床応用のためのよいクローンが選択されることが必要である。それには、マーカー遺伝子の発現だけでなく、in vitroでの分化特性、ゲノム・エピゲノムの完全性を確認する必要がある。臨床で広く用いられるには、健康なボランティアもしくは臍帯血ストックからの高品質のiPSCクローンのストックが必要となるだろう。さらに、HLA同型ドナーからのiPSCs作製により、免疫拒絶の少ない幹細胞治療が可能になると思われる。

iPSC技術は、科学のみならずビジネスや政治にも大きなインパクトを与えるだろう。しかし、iPSCsは厳格に科学的データに基づいて評価され、そのデータは臨床応用に向け徹底的に検討されるべきである。科学者は研究に集中し、政治やビジネスは科学研究によって得られた事実(hard evidence)のみに依拠するべきだろう。
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by md345797 | 2012-10-25 03:42 | 再生治療