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膵β細胞増殖を調節するホルモン・ベータトロフィン

Betatrophin: A Hormone that Controls Pancreatic β Cell Proliferation.

Yi P, Park JS, Melton DA.

Cell. 2013 May 9;153(4):747-58

【まとめ】
膵β細胞は主に自己複製によって生成される。β細胞の複製を刺激して、減少したβ細胞量を再度増加させることは1型、2型を問わず糖尿病の治療戦略としてきわめて重要である。本研究ではまず、マウスにインスリン受容体アンタゴニスト(S961)を投与してインスリン抵抗性を起こした際の代償的なβ細胞の増加が、他の方法による増加に比べ劇的に大きいものであることを見出した。そこでこのマウスモデルを用いて、肝と脂肪組織で発現が増加する遺伝子のマイクロアレイ解析を行い、主に肝からの分泌蛋白であるベータトロフィンを同定した。ベータトロフィンは急速かつ強力に、β細胞を特異的に増殖させるホルモンであり、肝でのベータトロフィン過剰発現によりマウスの血糖と耐糖能が改善されることが示された。将来的には、糖尿病患者にベータトロフィンを投与してβ細胞数を増加させることにより、インスリン注射の増強または代替治療が可能になると思われる。
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【論文内容】
新しいβ細胞の大部分は自己複製によって生成される(Dor et al., 2004; Meier et al., 2008; Teta et al., 2007)。マウスやヒトのβ細胞は、胎生期と新生児期に急速に増加するが、その後は極めて遅い速度 で複製する(1日に0.5%未満が分割するのみ) 。ただし、妊娠中や高血糖時、膵が傷害を受けた際、末梢のインスリン抵抗性がある場合などはβ細胞の複製速度は上昇する能力を持っている。このβ細胞増殖の遺伝的メカニズムはよく分かっておらず、細胞周期調節因子(cyclin D1/D2 やCDK4)、細胞周期関連転写因子(E2F1/2)が重要な働きを担い、細胞周期抑制因子(p15Ink4b、p18Ink4c、p27Kip1)はβ細胞複製を抑制し、その他の蛋白(NFAT、Menin、p53、Rb、Irs2)がβ細胞複製に関与しているなどのことが分かっているのみである。これらのβ細胞に内在する因子のほかに、全身性の因子の存在が報告されている。まずはグルコースそのものがβ細胞複製を刺激する因子である。グルコキナーゼ欠損でβ細胞増殖が低下するが、グルコキナーゼ活性化薬はβ細胞複製を2倍程度に増加させる(Porat et al., 2011)。インスリンを初めとするホルモン(ほかには胎盤性ラクトゲン、プロラクチン)やGLP-1、GIPなどのインクレチンはβ細胞複製を促進する。しかし、現在までにβ細胞のみを強力に増殖させる因子は知られていない。肝特異的インスリン受容体欠損(LIRKO)マウスでは代償的にβ細胞複製が増加し(Michael et al., 2000)、肝にconstitutively active MEK1を発現させた場合は神経依存的なメカニズムを介してβ細胞複製が増加する(Imai et al., 2008)。最近では、肝から分泌され膵島に直接作用する因子の存在も報告されている(El Ouaamari et al., 2013)。

本研究では、β細胞複製を調節する分泌シグナルの同定を試みた。まず、マウスにインスリン受容体アンタゴニストを投与し、インスリン抵抗性の代償的にβ細胞複製を起こす新しいインスリン抵抗性モデルマウスを作製した。このマウスモデルを用いて、インスリン抵抗性の状態において肝と脂肪組織で発現が増加する遺伝子を同定した。この遺伝子がコードする分泌蛋白は、β細胞を特異的にかつ著明に増殖させて耐糖能を改善する作用を持っていたため、ベータトロフィン(betatrophin)と命名した。

インスリン受容体アンタゴニストS961投与により、インスリン抵抗性・β細胞増殖マウスモデルを作製
43アミノ酸からなるペプチドS961(Schäffer et al., 2008)は、インスリン受容体に結合しそのシグナル伝達を阻害するインスリン受容体アンタゴニストである。浸透圧ポンプを用いてマウスにS961を投与したところ、S961の用量依存的に高血糖と耐糖能異常を起こすことができた。また、これらのマウスではβ細胞の代償的な作用によって血漿インスリン濃度は増加した。

S961投与によりβ細胞複製(Ki67免疫染色による)が著明に増加したが、この反応は直ちに起こり、かつS961の用量依存的で、持続的であった(投与4日目で反応が正常化した)。このβ細胞複製は核のβ細胞マーカー(Nkx6.1)、細胞分裂マーカー(PCNA)の免疫染色、細胞周期調節因子の定量的PCR解析の結果からも確認できた。なお、血糖変化が起こらない程度の低用量S961投与であっても4.3倍程度の、高用量S961投与では12倍ものβ細胞複製が認められた。これは今までの薬物投与で報告されたβ細胞複製率をはるかに超える高率なものである

このβ細胞複製増加はすべての膵島で同様に起きており、その結果β細胞面積は1週間で3倍程度まで増加した。S961投与でこのようなβ細胞量の増加が起きたものの、膵のインスリン含量は減少していた(インスリン抵抗性に伴い多くのインスリンを血中に分泌してしまうためか)。低用量S961の7日間投与ではKi67で測定したβ細胞複製は増加しなかったのに、β細胞量は1.5倍多くなっていた。S961投与によりβ細胞のサイズに変化はなかった。したがって、低用量S961の7日間投与によるβ細胞量の増加は、β細胞の過形成(サイズの増大)が原因ではなく、7日目より前の一時的なβ細胞増殖の結果ではないかと考えられた。S961投与による細胞増殖はβ細胞に特異的であり、膵の他の系列の細胞(内分泌、外分泌を含む)、肝や脂肪の細胞の増殖は認められなかった。

S961投与マウスの肝と白色脂肪組織からのベータトロフィンの同定
In vitroでマウスβ細胞にS961を添加しても、直接の細胞増殖効果は認められなかった。そこで、S961が代謝関連臓器(肝、白色脂肪組織、骨格筋)に作用することにより間接的にβ細胞に作用すると考え、これらの臓器における遺伝子発現をマイクロアレイで検討した。その結果、S961を投与したマウスの肝で4倍、白色脂肪組織で3倍に発現が増加した(骨格筋とβ細胞での発現は変化なかった)1つの遺伝子を同定し、これをベータトロフィンと名付けた(右図)。d0194774_10144113.jpg

この遺伝子は198アミノ酸からなる蛋白をコードしていた。なお、この遺伝子はマウスの遺伝子でGm6484、蛋白でEG624219、ヒトの遺伝子でC19orf80、蛋白でhepatocellular carcinoma-associated protein TD26と注釈(annotation)が付けられていたものである。ベータトロフィン遺伝子は他の遺伝子であるDock6の逆ストランドのイントロン中にある4つのエクソンからなり、哺乳類で高度に保存されている遺伝子であった。

ベータトロフィンは肝と脂肪組織に多く、その発現はβ細胞増殖率に関連する
ベータトロフィンmRNAはマウスの肝と脂肪に発現し、他の臓器の発現は少なかった。ヒトではベータトロフィンは主に肝に発現していた(他の臓器に比べ250倍以上のmRNA発現が見られた)。マウスへのS961注入によるβ細胞複製増加の際には、肝で6倍、白色脂肪組織で4倍のベータトロフィン発現の増加が認められた。インスリン抵抗性モデルであるob/obおよびdb/dbマウスの肝でも3-4倍のベータトロフィンmRNA発現の増加が見られ、妊娠中の肝では20倍の増加が認められた。一方、ジフテリア毒素を用いたβ細胞の特異的な欠損モデルでは肝でのベータトロフィンmRNA増加は認めなかった。以上より、ベータトロフィン発現増加はインスリン抵抗性による生理的な代償性β細胞増殖には関与しているが、膵の急性傷害時の再生反応には関与していないことが示された。

ベータトロフィン遺伝子は分泌蛋白をコードする
マウスとヒトのベータトロフィンの配列解析では、N端の分泌シグナルと2つのcoiled-coilドメインを持つことが分かった。そこで、マウスおよびヒトベータトロフィン遺伝子のC端にMyc-tagを付加したもの(mbetatrophin-Mycおよびhbetatrophin-Myc)を発現ベクターに組み込んで、培養細胞に発現またはhydrodynamic tail vein injection法によりマウスの肝に発現させた。その結果、Myc-taggedベータトロフィン蛋白が培養細胞上清およびマウス血漿中で確認され、ベータトロフィンが分泌蛋白であることが示された。ベータトロフィンはヒト血漿中にも検出され、in vivoでの内因性分泌蛋白であることが分かった。

(hydrodynamic tail vein injection法:
目的遺伝子をsleeping beautyトランスポゾン骨格中でCAGプロモーターまたはEF1aプロモーター下に発現させるプラスミドDNA 100 mgにsleeping beauty transposase発現プラスミド (pCMV-SB100) 4 mgを加え、滅菌生理食塩水で希釈してマウス尾静脈から注入し肝で発現させる方法。)

ベータトロフィンをマウス肝で発現させると、劇的なβ細胞特異的増殖が起き、耐糖能が改善する
マウス肝にhydrodynamic injection法を用いてベータトロフィン(またはコントロールのGFP)遺伝子を含むプラスミドを注入したところ、5-10%の肝細胞に少なくとも8日間にわたってベータトロフィンが発現した。その結果β細胞増殖率は、コントロールの0.27%に対して平均4.6%(17倍)に増加し、多いものでは8.8%(33倍)にも増加した
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(上図)マウス肝にベータトロフィン(上段)を過剰発現させると、GFPを過剰発現させたコントロール(下段)に比べ、β細胞(insulin染色で緑色)のうち複製しているもの(Ki67染色で赤色、重ね合わせ像で黄色)の割合が著明に増加した。
(下図)膵切片の弱拡大像(左右はいずれも代表的な切片)。マウス肝のベータトロフィン過剰発現により、白く囲まれたβ細胞領域のうち、複製しているもの(Ki67染色で白い点として見える)の割合が著明に増加していた。

なお、このβ細胞増殖は核マーカーであるNkx6.1や細胞分裂マーカーPCNAの免疫染色、cyclin、CDKs、E2Fsの定量的PCRでの増加でも確認された。また、このβ細胞の増殖はすべての膵島で観察された。ベータトロフィン過剰発現マウスでは、β細胞数と総β細胞量の増加も認められ、膵島サイズの増大と膵の総インスリン量の増加(2倍程度)が見られた。このベータトロフィン発現による複製刺激はβ細胞に特異的なものであり、膵の他の細胞系列や他の臓器(肝、白色・褐色脂肪組織)にはほとんど認められなかった。

次に、ベータトロフィン遺伝子注入マウスの膵島を単離し、グルコース応答性インスリン分泌(glucose-stimulated-insulin-secretion, GSIS)を調べた。その結果、ベータトロフィン遺伝子注入とコントロールのGFP遺伝子注入マウスで膵島のGSISに差は認められず、ベータトロフィンによって増殖したβ細胞は正常な機能を維持していることが示された。さらに、これらのマウスにグルコース負荷試験を行ったところ、ベータトロフィン遺伝子注入マウスはコントロールマウスに比べ空腹時血糖が低く、耐糖能が改善していた。ベータトロフィン発現により空腹時血漿インスリン値は軽度に増加していたのみだったが、これは絶食時間が比較的短いためか、グルコース感受性亢進のためと考えられた。インスリン負荷試験を行ったところ、ベータトロフィン遺伝子注入マウスとコントロールマウスの間にインスリン感受性の差は認められなかった(S961投与では強いインスリン抵抗性が生じる)。すなわち、ベータトロフィンはインスリン抵抗性の発症を介することなく、β細胞複製を促進していると考えられた。(「ベータトロフィンがまずインスリン抵抗性を発症し、これにより代償的なβ細胞増殖を起こしている」のではないことは、ベータトロフィン過剰発現マウスで空腹時血糖が低値であることからも分かる。)

【結論】
マウスおよびヒトのベータトロフィンであるGm6484/TD26遺伝子については、肝と脂肪に多く発現する遺伝子として最近3つ報告がある(Quagliarini et al., 2012; Ren et al., 2012; Zhang, 2012)。これらはリポ蛋白リパーゼ阻害により血清トリグリセリドの調節について報告しているが、β細胞や糖代謝、糖尿病に対する効果については報告していない。今回、β細胞に対する効果が初めて明らかになった。過去のβ細胞複製率についての報告は、妊娠で4倍(Karnik et al., 2007)、高グルコース注入で2-4.5倍(Alonso et al., 2007)、exendin-4投与で2.6倍(Xu et al., 1999)、β細胞傷害モデルで4倍(Nir et al., 2007)、LIRKOマウスで6倍(Okada et al., 2007)程度である。しかし、今回報告したベータトロフィン遺伝子注入では数日で平均17倍(多いもので33倍)と極めて急速で強力な効果が認められた。今後、遺伝子組み換えベータトロフィン蛋白の作製とその直接注入によるβ細胞複製への効果を検討することが重要であろう。ベータトロフィンの作用機序については不明であり、ベータトロフィンのβ細胞への作用は直接作用か間接作用か、ベータトロフィン受容体や他のcofactorがあるのかなども今後検討が必要である。


◇本研究について著者Douglas A. Meltonの動画

◇ベータトロフィンを用いた治療が実現すれば、内在性のβ細胞の数を増加させることが可能となるため、2型糖尿病の進行を遅らせる極めて有効性の高い治療法となるだろう。さらに、小児1型糖尿病の発症初期や1型糖尿病「ハネムーン期」などβ細胞がまだ残存している場合に投与すれば、1型糖尿病発症を防止できるかもしれない。

◇Harvard Universityは、Evotec社(ドイツ・ハンブルク)およびJanssen Pharmaceuticals社(Johnson & Johnson社の一部門)と研究契約「CureBeta」を結び、ベータトロフィンの治療応用に向けた研究を進めている。著者らは「今後3年から5年以内にベータトロフィンの臨床試験が行えるだろう。頻回インスリン注射の代わりに、週1回、月1回、理想的には年1回の投与頻度で行える糖尿病治療が可能になるだろう」と考えている。

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by md345797 | 2013-04-27 10:17 | 再生治療

腸内細菌叢によるphosphatidylcholineの代謝産物TMAOはヒトの心血管疾患リスク増加に関連

Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk.

Tang WHW, Wang Z, Levison BS, Koeth RA, Britt EB, Fu X, Wu Y, Hazen SL.

N Engl J Med. 2013; 368:1575-1584. April 25, 2013.

【まとめ】
背景:最近のマウスを用いた検討により、食餌中のphosphatidylcholine (lecithin)のcholine部分から、腸内細菌叢の代謝によってtrimethylamineが生成され、それが肝で代謝されてtrimethylamine-N-oxide (TMAO)となり、これが動脈硬化性の心血管疾患の発症に関連があることが示されている。本研究ではヒトにおいて、①食事中のphosphatidylcholineの腸内細菌叢による代謝、および②TMAO値と心血管イベントの関係について検討した。方法:①健常者に広範囲抗生剤を投与して腸内細菌叢を抑制した前と後で、phosphatidylcholine負荷(ゆで卵2つとdeuterium [d9]ラベルしたphosphatidylcholineを摂取)を行い、血漿中および尿中のTMAO値、血漿choline、betaine(choline代謝産物)値を定量した。②さらに、待期的冠動脈造影を受けた4007人の患者を3年間追跡し、ベースラインの空腹時血漿TMAO値と心血管イベント(死亡、心筋梗塞、脳梗塞)の発症率との関連を検討した。結果:①Phosphatidylcholine負荷後に、時間依存的にTMAO値とラベルされたTMAO(d9 isotopologue)値、および他のcholine代謝産物の増加が認められた。抗生剤投与後は血漿TMAO値は著明に抑制され、抗生剤を中止すると再度上昇した。②また、空腹時血漿TMAO高値は冠動脈イベントのリスク増加と関連があった。既知の危険因子で補正した後であっても、TMAO高値は心血管イベントのリスク増加と関連していた。結論:①食事中のphosphatidylcholineからTMAOが産生されるためには、腸内細菌叢による代謝が必要である。②TMAO値の増加は心血管イベントの発症リスクの増加に関連している。
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【論文内容】
リン脂質であるphosphatidylcholine (lecithin)は食事中の主要なcholine源である。Cholineは脂質代謝や細胞膜の構成に必要であり、そのほかにも神経伝達物質アセチルコリンの前駆体であるなどさまざまな役割を持つ。また、cholineの代謝産物(betaineなど)はある種のアミノ酸に正しくメチル基を負荷するために必要である。このグループは、マウスモデルにおいて腸内細菌叢によるphosphatidylcholine–cholineの代謝経路が動脈硬化性の冠動脈疾患の発症に関与することを報告した。また、phosphatidylcholineのcholine部分の腸内細菌叢依存性代謝産物であるTMAOの空腹時血漿中の値と心血管疾患の罹患歴に関連があることも報告している。今回の研究では、①ヒトにおけるphosphatidylcholineの経口摂取と腸内細菌叢によるTMAO産生の関連について検討した。②また、空腹時血漿TMAO値と長期の心血管イベント発症リスクの関連についても検討した。

① Phosphatidylcholine負荷
40人の健康な成人にphospahtidylcholine負荷を行い、そのうち6人に抗生剤(メトロニダゾールとシプロフロキキサシンを1週間)投与した後に2回目のphosphatidylcholine負荷を行った。さらに、抗生剤中止1か月以上後に腸内細菌叢の回復を待って3回目のphospahtidylcholine負荷を行った。Phospahtidylcholine負荷は、2つの固ゆで卵とトレーサーとしてdeuteriumラベルしたphosphatidylcholine (d9-phosphatidylcholine)を摂取させ、摂取前後の血液と24時間蓄尿で代謝産物を評価するという方法で行った。内因性の(ラベルされていない)TMAOとcholine、betaineが空腹時血漿に認められるが、負荷後はTMAOおよびd9-TMAOが血漿と尿中に出現した。抗生剤投与1週間(腸内細菌叢抑制)には、血漿および尿中のTMAOとd9-TMAOはほぼ完全に消失していた。(Phosphatidylcholine負荷後のcholineとbetaineの増加は変化がなかった。)さらに、抗生剤中止1か月以上後の腸内細菌叢が回復した状態では、phosphatidylcholine負荷後に血漿と尿中のTMAOおよびd9-TMAOの増加が認められた。

② 臨床的なアウトカム
(1) TMAO値と心血管イベントの関連

待期的冠動脈造影を受けて、少なくとも1枝病変があり心血管リスクが高い4007人の成人を対象に、冠動脈カテーテル検査時に血液サンプルを採取し、その後3年間主要な心血管イベントの発症がないかを追跡調査した。(これらの対象患者の心血管リスクは、高齢、高血糖、高率の糖尿病と高血圧の合併および心筋梗塞の既往である。)これらの対象患者のうち、心血管イベントを発症した患者のベースラインの血漿TMAO値は、発症しなかった患者の値より有意に高かった。TMAO値の最低四分位の患者は、最高四分位の患者に比べイベント発症リスクが高かった(hazard ratio 20.54, 95% CI 1.96-3.28, P<0.001)。既知の危険因子とベースラインの共変数で補正した後であっても、TMAO高値は心血管イベントの有意な危険因子であった。Kaplan-Meier解析でリスクの増加を比較すると、いずれのTMAO値でもリスク増加は同様に認められた(下図)。(unadjusted hazard ratio, 1.40 [95% CI, 1.29-1.51; P<0.001]; adjusted hazard ratio, 1.30 [95% CI, 1.20-1.41; P<0.001])
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なお、心血管イベントの要因を別々に解析してもTMAO値の増加はリスク増加に有意に関連していた(死亡に対してはhazard ratio, 3.37; 95% CI, 2.39-4.75; P<0.001、非致死的心筋梗塞と脳梗塞に対しては、hazard ratio, 2.13; 95% CI, 1.48-3.05; P<0.001)。既知の危険因子にTMAOを共変数として含むと、リスク予測は有意に改善した(net reclassification improvementとintegrated discrimination improvementでみる改善度は、それぞれNRIが 8.6% [P<0.001]およびIDIが9.2% [P<0.001]; リスク評価の正確性を表すC 統計量が68.3% vs. 66.4% [P=0.01]と改善が認められた)。

(2) 低リスクサブグループの心血管リスク
血漿TMAO値上昇の心血管リスク上昇は、リスクが低い群でも有意に予後予測的な価値を持っていた。(これらの低リスク群は、若い年齢(65歳未満)、女性、冠動脈疾患の既往なし、脂質異常やアポ蛋白異常が少ない、血圧低値、非喫煙者、リスクマーカー(CRP、myeloreoxidase、白血球数)の増加が少ないなどのグループである。)

【結論】
Phosphatidylcholineは卵、レバー、牛肉、豚肉に多く含まれ、腸内細菌叢で代謝されtrimethylamineを経て肝で代謝されてTMAOになり、これが動脈硬化促進的に働くことがマウスを用いた検討および臨床研究で示されている。本研究では、①アイソトープトレーサーを用いて食事中のphosphatidylcholineからTMAOが産生されることを示し、これが抗生剤投与で消失、抗生剤中止で回復することを確認した。さらに、②空腹時血漿TMAO値が、既知の危険因子とは独立して心血管イベントのリスクを予測する因子であることを明らかにした。


(なお、形質に影響する要因を「遺伝要因」と「環境要因」にはっきり区別して考えるガルトン的な考え方(Galton, 1875)はもはや単純化しすぎの二分法であろう。現代では、環境はエピジェネティックな過程や転写後修飾を通して遺伝的機能を変え、遺伝は環境へのストレス耐性などの因子を変えることが知られているからである。さらに最近では、食事中の成分が腸内細菌叢に影響を与え、宿主の100倍以上の遺伝子を含む腸内細菌叢のゲノムであるmicrobiomeが宿主の疾患に大きく影響していることなどが明らかになってきた。すなわち、宿主ゲノムとmicobiomeが相互作用することにより「supraorganismal」な代謝を形成し、遺伝・環境因子を統合して形質形成に関わっていると考えられている。本研究では、「環境からのphosphatidylcholine摂取が、腸内細菌叢による代謝を経てTMAOを生成し、それがヒトの動脈硬化性疾患を促進する」という宿主と環境の複雑な相互作用が明らかになった。)
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by md345797 | 2013-04-26 07:27 | 心血管疾患

GLP-1受容体アゴニストは心房においてEpac2を介してANP分泌を増加させることにより血圧低下をもたらす

GLP-1 receptor activation and Epac2 link atrial natriuretic peptide secretion to control of blood pressure.

Kim M, Platt MJ, Shibasaki T, Quaggin SE, Backx PH, Seino S, SimpsonJA, Drucker DJ.

Nature Medicine. Published online 31 March 2013.

【まとめ】
GLP-1受容体(GLP-1R)アゴニストには血圧低下作用があるが、そのメカニズムはよく分かっていない。本研究では、心臓のGlp1r発現が心房に限局しており、心房心筋細胞におけるGLP-1Rの活性化がANP(心房性ナトリウム利尿ペプチド)の分泌を促進して血圧を下げる機構を解明した。GLP-1Rアゴニストであるリラグルチドは、直接cGMPを増加させたり、前収縮させた大動脈輪を拡張したりすることはないが、リラグルチドを潅流させた心臓の潅流液は内皮細胞非依存性、GLP-1R依存性に大動脈輪を拡張させた。なお、Glp1r−/−マウスやNppa−/−(ANP欠損)マウスにリラグルチドを投与しても、ANP分泌増加、血管拡張、血圧低下は起きなかった。心筋細胞においてGLP-1Rを活性化させると、Rap guanine nucleotide exchange factor であるEpac2が膜にtranslocationしたが、Rapgef4−/− (Epac2)欠損マウスではGLP-1R依存性のANP分泌増加は起こらなかった。野生型マウスの絶食後再摂食で(生理的なGLP-1増加によって)血漿中ANP濃度の増加が起きたが、Glp1r−/−マウスでは摂食後にANP濃度は増加しなかった。また、リラグルチドを投与した野生型マウスでは尿中Na排泄が増加したが、Nppa−/−マウスではリラグルチド投与で増加しなかった。以上の結果から、腸管から心臓に至るGLP-1R依存的、ANP依存的な経路(GLP-1R-ANP軸)が血圧調節に役立っていることが明らかになった。

【論文内容】
GLP-1には血圧を下げる作用があることが知られていたが、これはGLP-1が直接血管に作用して血管拡張をもたらすためと考えられ、GLP-1の血管平滑筋や内皮細胞に対する作用やNOを介する機構が想定されてきた。また、GLP-1の腎臓に対する作用としてNa利尿を促進し、腎細胞のNa調節蛋白のリン酸化を変化させる作用があるため、GLP-1が腎を介して血圧を下げている可能性も考えられていた。そこで本研究では、GLP-1Rアゴニストの血圧低下作用のメカニズムについて検討した。

リラグルチドはGLP-1Rを介して血圧を低下させる
C57BL/6 (WT)マウスにangiotensin II (Ang II)を注入して血圧上昇マウスモデルを作製した。このマウスに分解抵抗性のGLP-1Rアゴニストであるリラグルチド(薬品名:ビクトーザ)を投与すると、収縮期血圧、拡張期血圧がそれぞれ23、19 mmHg低下した。しかし、Ang IIを注入したGlp1r−/−マウスにリラグルチドを投与しても血圧の低下は見られなかった。次に、WTマウスに2日間exendin9–39 (GLP-1Rアンタゴニスト)、L-NMMA (NO synthase inhibitor阻害剤) 、またはanantin (natriuretic peptide receptorアンタゴニスト)を投与しておいたところ、exendin9–39およびanatinでリラグルチドの降圧効果は阻害されたが、L-NAMEでは阻害されなかった。Anantinでリラグルチドの降圧効果が阻害されたことにより、この効果はnatriuretic peptide receptor Aを介するものであると考えられた。Phenylephrineを用いて収縮させた大動脈輪にin vitroでリラグルチドを添加しても直接の血管拡張効果は認められなかったが、acetylcholine (Ach)を添加すると直接の血管拡張効果があった。Achの添加により、大動脈輪の内皮細胞のeNOS やvasodilator-stimulated phosphoprotein (Vasp:NO-cGMPシグナル伝達経路の下流)のリン酸化は増加し、cGMP量を増加した。一方、リラグルチドは、eNOS、Vaspリン酸化、cGMP量の増加に対する直接の効果はなかった。以上の結果により、リラグルチドは血管に対して直接の血管拡張作用を及ぼすのではないと考えられた。

リラグルチドはANP分泌を刺激する
上の実験でanantinがリラグルチドによる血圧低下を阻害したため、リラグルチドの効果はatrial natriuretic peptide (ANP)またはbrain natriuretic peptide (BNP)を介するものではないかと考えられた。そこでWTマウスにリラグルチドの急性投与を行ったところ、血漿ANP濃度が1.8倍に上昇した(BNPは変化なし)。Ang II注入マウスはベースラインの血漿ANP濃度が高かったが、このマウスにリラグルチドを投与すると二相性のANP濃度変化が起きた(最初にANP濃度が低下した後、160分後にその3.7倍まで上昇)。一方、リラグルチドはGlp1r−/−マウスの血漿ANP濃度は増加させなかった。また、リラグルチドを3週間にわたって1日2回慢性投与した場合には、持続的にANP濃度が増加し、血圧が低下した。(なお、Ang II注入とは別の、経大動脈収縮(TAC)に伴う圧負荷による高血圧モデルマウスでも、リラグルチドはANP濃度を増加させ、血圧を低下させた。また、リラグルチド以外のGLP-1そのものやexendin-4をAng II注入マウスに投与したところ、exendin-4では持続的な降圧効果、GLP-1では(in vivoでは急速に分解・不活化されるため)一時的で弱い降圧効果のみを示した。そこで、GLP-1、リラグルチド、exendin-4をそれぞれin vitroでWTの心房心筋細胞に添加したところ、いずれもANP分泌が増加した。Glp1r−/−マウスの心筋細胞ではその効果は見られなかった。)

次に、食事摂取による内因性のGLP-1の増加(=GLP-1濃度の生理的増加)によって血漿ANP濃度が増加するかを検討した。その結果、WTマウスでは空腹後の再摂食で急速にANP濃度の増加が認められたが、Glp1r−/−マウスではその効果は認められなかった。以上より、GLP-1Rの薬理学的活性化(リラグルチド投与)および生理的活性化(絶食後再摂食)によって、ANP分泌が促進されることが示された。

では、心臓におけるGLP-1R活性化はANP分泌を直接促進しているのかを検討するため、単離したマウス心臓にリラグルチドを潅流させ、その潅流液中のANP濃度を測定する実験を行った。WTマウスの心臓にリラグルチドを潅流させると、潅流液中のANP濃度は約5倍に増加した。Ang II注入高血圧マウスの心臓の潅流液ではベースラインのANP濃度が高かったが、リラグルチド潅流により潅流液中のANP濃度は10倍増加した。Ang II注入Glp1r−/−マウスの心臓でも潅流液中のベースラインのANP濃度は増加していたが、リラグルチドを潅流させた後の潅流液中のANP濃度は増加しなかった。以上の結果により、リラグルチドは、心臓のANP分泌を直接促進していると考えられた。さらに、リラグルチドを潅流させたWTマウス心臓の潅流液を収縮させた大動脈輪にin vitroで添加すると、容量依存性に大動脈輪が拡張したが、この拡張はGlp1r−/−マウスの心臓のリラグルチド潅流液では認められなかった。なお、血管内皮細胞をはがした大動脈輪では、Achに反応した血管拡張は消失したが、リラグルチド投与WTマウスの心臓潅流液反応性の血管拡張は保たれていた。このリラグルチド心臓潅流液を添加すると、大動脈輪のVaspのリン酸化が増加した。一方、リラグルチドを潅流させたGlp1r−/−マウスの心臓潅流液では、このVaspリン酸化増加は消失していた。以上の結果から、GLP-1R–ANP軸は(血管内皮細胞ではなく)血管平滑筋の緊張低下によって血圧低下をもたらすことが示唆された。

ANP受容体のシグナル伝達はguanylyl cyclaseを介している。リラグルチドを潅流させたWTマウス心臓の潅流液は大動脈輪のcGMP量の増加をもたらしたが、Glp1r−/−マウスの心臓潅流液ではcGMP増加は起きなかった。すなわち、リラグルチドはANP分泌を増加させ、標的(大動脈)のANP受容体に作用し、ANP受容体下流のcGMP増加を起こしていると考えられた。

リラグルチドはANPを介して、Na利尿と血管拡張を促進する
次にリラグルチドの降圧効果におけるANPの重要性を検討するため、ANP欠損(Nppa−/−)マウスを用いた。リラグルチドは、正常血圧およびAng II注入高血圧WTマウスの尿中Na排泄を増加させたが、Nppa−/−マウスでは尿中Na排泄増加は認められなかった。Nppa−/−(ANP欠損)マウスはNppa+/+マウスに比べ、ベースラインの血圧が有意に高い。リラグルチド投与により、Ang II注入高血圧Nppa+/+マウスの血圧は有意に低下したが、Nppa−/−マウスの血圧は低下しなかった。なおNppa−/−マウスにおいても、GLP-1の他の作用(血糖低下、血漿インスリン値の低下、摂食と胃内容排出の抑制)は認められたため、上記の作用はANP欠損マウスでGLP-1Rの作用が全身的に低下しているためではないことが分かる。リラグルチドを潅流させたNppa+/+マウスの心臓の潅流液をin vitroで大動脈輪に添加すると血管拡張とVaspのリン酸化増加が起きたたが、Nppa−/−マウスの心臓潅流液ではそれらの効果は見られなかった。したがって、GLP-1R活性化がマウス心房からのANP分泌を促進し、これが血管のVaspリン酸化、cGMP生成、大動脈平滑筋の拡張とNa利尿を促進することにより血圧が低下するというメカニズムが想定された。

リラグルチドによるANP分泌促進はEpac2を介する
GLP-1は膵β細胞でcAMP依存性経路を活性化するが、心筋細胞でも同様のcAMPを介するシグナル伝達経路を活性化するかを検討した。その結果、リラグルチドはAng II注入高血圧Glp 1r+/+マウスの心房心筋細胞でcAMPを増加させたが、Glp 1r-/-マウスでは増加させなかった。さらに、マウスから取り出した心臓にH-89(PKA阻害剤)、SB203580(p38MAPK阻害剤)または2-APB(inositol 1,4,5-triphosphate受容体アンタゴニスト)を潅流させ、その直後にリラグルチドを潅流させ、その潅流液中のANPの増加を調べた。リラグルチドはex vivoで、PKA、p38MAPK、inositol 1,4,5-triphosphate受容体のいずれにも非依存性にANP分泌を増加させた。しかし、exendin 9-39(GLP-1Rアンタゴニスト)、U73122(phospholipase C阻害剤)の潅流後は、リラグルチド潅流によるANP分泌促進は阻害された。Epacの選択的活性化剤であるESCA-AMは、それだけでもANP分泌を増加させ、その増加はリラグルチドによるANP分泌増加と相加的ではなかった。したがって、リラグルチドによるANP分泌促進は、cAMP依存的であってもPKA非依存的であり、PLC依存的なシグナル伝達を介すると考えられた。β細胞ではGLP-1R活性化によるcAMP増加はEpac2のtranslocationを活性化するため、心筋細胞でも同様の変化がないかを検討した。その結果、Glp 1r+/+心筋細胞はリラグルチド添加によって細胞質内Epac2が減少し、膜分画でのEpac2が増加した。この変化はGlp 1r-/-心筋細胞では見られなかった。

リラグルチドはGlp 1r+/+の心房 (Glp 1rが主に局在しているのは心房)の心筋細胞ではANP分泌を増加させたが、心室の心筋細胞では増加させなかった。Glp 1r-/-の心房心筋細胞ではリラグルチドを添加してもANP分泌は変化なかった。しかし、ESCA-AMの添加では、Glp 1r+/+でもGlp 1r-/-でも心房、心室の心筋細胞でANP分泌が増加した(心筋のANP分泌は心房に比べ少ない)。

リラグルチドによる血圧低下にはEpac2が必要である
そこでリラグルチドによるANP分泌促進および血圧降下にはEpac2が必要と考え、Epac2をコードする遺伝子であるRapgef4の欠損マウスを用いた実験を行った。なお、Rapgef4+/+マウスもRapgef4-/-マウスも、心房におけるGlp 1rの発現は同程度であった。リラグルチドは、Rapgef4+/+マウスの心房心筋細胞のANP分泌を直接刺激したが、Rapgef4-/-マウスではその効果は認められなかった。Ang II注入マウスの心臓へのリラグルチド潅流でもRapgef4+/+マウスではANP分泌が増加したが、Rapgef4-/-マウスでは増加しなかった。さらに、Rapgef4+/+マウスの心臓リラグルチド潅流液は収縮した大動脈輪を拡張させたが、Rapgef4-/-マウスを用いた潅流液では拡張させなかった。なお、Rapgef4-/-マウスの心筋細胞にアデノウイルスを用いて後からEpac2を発現させると、リラグルチドによるANP分泌増加が回復した(したがって、上記のRapgef4-/-心筋細胞のリラグルチド反応性の低下はEpac2欠損による発生過程の異常によるものではないことが分かる)。以上の結果より、GLP-1RによるANP分泌促進はEpac2を介していることが確認された。

【結論】
GLP-1アゴニストには血圧降下作用があることが知られているが、それは心房からのANP分泌増加を介していることが明らかになった。本研究で明らかになったGLP-1による降圧の機構は下図のようなものである。

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GLP-1は心房の心筋細胞のGLP-1Rを活性化させ、心筋細胞内のcAMPを増加させる。この心房心筋細胞のcAMP増加は、(PKA活性化ではなく)Epac2のtranslocationを介して、large dense core vesicle(LDCV)からのANP分泌を増加させる。 ANPは、標的である血管平滑筋においてcGMPを介して血管拡張を起こし、さらに腎においてNa利尿を起こすことにより、血圧低下をもたらす。

なおANPには、脂肪分解を促進したり、脂肪細胞の熱産生を増加させたり、骨格筋細胞の脂肪酸化や酸化的リン酸化を増加させたり、グルコース応答性のインスリン分泌を増加させたりする新しい役割があることが知られるようになってきた。本研究の結果から考えると、GLP-1のさまざまな代謝作用は心臓からのANP分泌増加を介しているのかもしれず、GLP-1R-ANP軸 (腸管-心臓軸)がGLP-1作用に重要な役割を果たしている可能性も示唆される。
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by md345797 | 2013-04-02 02:52 | シグナル伝達機構